La esterilización es un método de
eliminación total de todo tipo de organismo que asegura la ausencia absoluta de
cualquier forma viviente. Una esterilización deficiente o manipulación
incorrecta de materiales y medios de cultivo conlleva a contaminaciones,
resultados erróneos o pérdida del material biológico. Por ello, se requieren
buenas prácticas de laboratorio para su adecuado manejo.
La esterilización por calor seco
o húmedo son los métodos que se utilizan con mayor frecuencia en el Laboratorio
de Microbiología. El calor seco destruye a los microorganismos por oxidación,
por ejemplo, al exponerlos directamente a la flama de un mechero o en horno a
150-180°C durante 2 horas. Estos métodos se aplican en la esterilización de
asas de inoculación y para todo tipo de material de vidrio y quirúrgico.
Los procesos con calor húmedo
afectan la estabilidad de estructuras celulares y proteínas; se aplican para
esterilizar medios de cultivo, soluciones termoestables, materiales de vidrio y
cultivos bacterianos que se desechan.
El equipo de uso común es la
autoclave, que utiliza vapor de agua a presión (15 lb/in^2); con esta presión
el material alcanza una temperatura de 121 °C y si se mantiene durante 15
minutos se asegurará la inactivación de endosporas, que son las estructuras
bacterianas más resistentes al calor.
Como en los estudios de
microbiología se requiere la esterilización de espacios, superficies y
materiales de naturaleza diversa (plástico, vidrio, instrumentos, medios de
cultivo, cultivos para desechar, etc.), hay diferentes métodos que se aplicarán
de acuerdo con el tipo de materiales requeridos, tal como se observa en la
Tabla 2.
Tabla 2. Métodos de esterilización.
Dependiendo de la cantidad de microorganismos esperados en una muestra,
se requerirá realizar diluciones para el examen microbiológico de alimentos. La
dilución primaria tiene por objeto obtener una distribución lo más uniforme
posible de los microorganismos contenidos en la muestra destinada para el
análisis. La preparación de diluciones decimales adicionales, si son necesarias,
tiene como objetivo reducir el número de microorganismos por unidad de volumen,
para permitir, después de la incubación, la observación de la prueba en el caso
de tubos o matraces y la cuenta de colonias en el caso de placas. Dilución
primaria, es la solución, suspensión o emulsión obtenida después de pesar o
medir una cantidad del producto bajo examen y mezclarla con una cantidad de
nueve veces en proporción de diluyente. Diluciones decimales adicionales, las
suspensiones o soluciones obtenidas al mezclar un determinado volumen de la
dilución primaria con un volumen de nueve veces un diluyente y que por
repetición de esta operación con cada dilución así preparada, se obtiene la
serie de diluciones decimales adecuadas para la inoculación de medios de
cultivo.
Cuando se requiere investigar el contenido de
microorganismos viables en un alimento, la técnica comúnmente utilizada es la
cuenta en placa. Esta técnica no pretende poner en evidencia todos los
microorganismos presentes. La variedad de especies y tipos diferenciables por
sus necesidades nutricionales, temperatura requerida para su crecimiento,
oxígeno disponible, etc., hacen que el número de colonias contadas constituyan
una estimación de la cifra realmente presente y la misma refleja si el manejo
sanitario del producto ha sido el adecuado. Por otra parte, el recuento de termofílicos, psicrofílicos y
psicotróficos es importante para predecir la estabilidad del producto bajo
diferentes condiciones de almacenamiento. El fundamento de la técnica consiste
en contar las colonias, que se desarrollan en el medio de elección después de
un cierto tiempo y temperatura de incubación, presuponiendo que cada colonia
proviene de un microorganismo de la muestra bajo estudio. Unidades Formadoras
de Colonias (UFC), es el término que debe utilizarse para reportar la cuenta de
colonias en placa, las cuales pueden surgir de una célula o de un cúmulo de
células.
Que el alumno aprenda el procedimiento para la esterilización
de material para análisis microbiológico, la elaboración de medios de cultivo,
la preparación de diluciones para el análisis microbiológico de productos alimenticios
y estime la cantidad de microorganismos viables presentes en
un alimento, agua potable y agua purificada, por la cuenta de colonias en un
medio sólido, incubado aeróbicamente.
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Los reactivos que a continuación se mencionan, deben ser
grado analítico.
Cuando se indique agua,
debe entenderse agua destilada, con pH cercano a la neutralidad.
Preparación de reactivos
Solución de hidróxido de sodio 1,0 N
INGREDIENTES CANTIDADES
Hidróxido de sodio 4,0 g
Agua 100,0 ml
Preparación:
Disolver el hidróxido de sodio y llevar a 100 ml con agua.
Soluciones diluyentes
Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada).
INGREDIENTES CANTIDADES
Fosfato de sodio monobásico 34,0 g
Agua 1,0 l
Preparación:
Disolver el fosfato en 500 ml de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución
de hidróxido de sodio 1,0 N.
Llevar a un litro con agua.
Esterilizar durante 15 minutos a 121° ± 1,0°C.
Conservar en refrigeración (solución concentrada).
Tomar 1,25 ml de la solución concentrada y llevar a un litro con agua
(solución de trabajo).
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml según se requiera.
Esterilizar a 121° ± 1,0°C durante 15 minutos.
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la
solución de trabajo deberán ser iguales a los iniciales.
Agua peptonada
INGREDIENTES CANTIDADES
Peptona 1,0 g
Cloruro de sodio 8,5 g
Agua 1,0 l
Preparación:
Disolver los componentes en un litro de agua.
Ajustar el pH a 7 ± 0,1 con hidróxido de sodio 1,0 N.
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml o en cualquier volumen múltiplo
de nueve según se requiera.
Esterilizar a 121 ± 1,0°C durante 15 minutos.
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la
solución de trabajo deberán ser iguales a los iniciales.
Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar oscuro
a una temperatura entre 0 a 5°C por un tiempo no mayor de un mes, en
condiciones tales que no alteren su volumen o composición.
Medio de Cultivo.
Agar Triptona-Extracto de Levadura (agar para cuenta
estándar).
INGREDIENTES CANTIDADES
Extracto de levadura 2,5 g
Triptona 5,0 g
Dextrosa 1,0 g
Agar 15,0 g
Agua 1,0 l
Preparación del medio de
cultivo.
Suspender los componentes
del medio deshidratado en un litro de agua. Hervir hasta total disolución. Distribuir en recipientes de vidrio esterilizables de capacidad
no mayor de 500 ml, cantidades de aproximadamente la mitad del volumen del
mismo. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1,0 ºC, durante 15 minutos. El pH final
del medio debe ser 7,0 ± 0,2 a 25ºC.
Si el medio de cultivo es
utilizado inmediatamente, enfriar a 45ºC ± 1,0 ºC en baño de agua y mantenerlo
a esta temperatura hasta antes de su uso. El medio no debe de fundirse más de
una vez.
En caso de medios
deshidratados seguir las instrucciones del fabricante.
El medio de cultivo
anterior es el de uso más generalizado. Para algunos alimentos en particular se
requerirá de un medio de cultivo especial que se debe indicar al describir la
técnica para ese alimento.
Materiales
- Erlenmeyer de 125 ml y 250 ml
- Probeta de 50 ml
- Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 ml (o si es necesario de 1 ml y 2 ml), con tapón de algodón. Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total.
- Cilindros de acero inoxidable para esterilizar pipetas
- Frascos de vidrio de 250 ml con tapón de rosca.
- Tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca.
- Gradilla
- Cajas de Petri de vidrio
- Cilindros de acero inoxidable para esterilizar cajas de Petri
- Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas, etc.
- Algodón, gasa, papel estrasa,
- Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras bajo estudio deberán esterilizarse mediante:
- Horno, durante 2 h a 170 a 175°C o 1 h a 180°C o
- Autoclave, durante 15 minutos como mínimo a 121 ± 1,0°C.
- El material de vidrio puede sustituirse por material desechable que cumpla con las especificaciones deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por esterilización repetida y éste debe ser químicamente inerte.
Aparatos e instrumentos
- Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170°C.
- Autoclave con termómetro y manómetro, calibrada con termómetro de máximas y mínimas.
- Baño de agua con control de temperatura y circulación mecánica, provista con termómetro calibrado con divisiones de 0,1°C y que mantenga la temperatura a 45 ± 0,5°C.
- Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato o bien un homogeneizador peristáltico (Stomacher).
- Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bolsas estériles para homogeneizador peristáltico.
- Balanza granataria con sensibilidad de 0,1 g.
- Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ± 1,0ºC, provista con termómetro calibrado.
- Contador de colonias de campo obscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadrículada y lente amplificador.
- Registrador mecánico o electrónico.
- Microscopio óptico.
De acuerdo a los Límites microbiológicos de la ICMSF (International Commission on
Microbiological Specifications for Foods). En los zumos, néctares, bebidas a base
de frutas y verduras no pasteurizadas los mesófilos aeróbicos que están
expresados en UFC/g se describen en un límite máximo permisible de 100,000. Ahora realizaremos la operación de acuerdo a nuestro conteo de colonias para saber si la muestra escogida, en este caso jugo de naranja, entra en el rango permisible establecido.
FÓRMULA:
Jugo de naranja:
10-1
1a –7 x10+1=
70
2a 6
x10+1=_60
130
2/130 = 65 UFC/g
Viendo los resultados obtenidos y apegándonos a los Límites microbiológicos de la ICMSF, podemos decir que el jugo del cual tomamos la muestra cuenta con menos mesófilos de los permisibles. Esto quiere decir que es un producto de buena calidad, el negocio cumple con las medidas de sanidad dado que el producto fue manejado higiénicamente y no repercutirá en nuestra salud.
Camacho,
A. M. (2009). Cuenta en placa de bacterias. (UNAM, Editor) Recuperado
el 28 de Abril de 2019, de
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/TecnicBasicas-Cuenta-en-placa_6527.pdf
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-092-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. MÉTODO PARA
LA CUENTA DE BACTERIAS AEROBIAS EN PLACA.
(10 de Noviembre de 1995). Recuperado el 28 de Abril de 2019, de
http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/092ssa14.html
NORMA Oficial Mexicana NOM-110-SSA1-1994, Bienes y servicios. Preparación
y dilución de muestras
de alimentos para su análisis microbiológico.
(10 de Mayo de 1995). Recuperado el 28 de Abril de 2019, de
http://www.ordenjuridico.gob.mx/Documentos/Federal/wo69533.pdf
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